Wykorzystanie przeprogramowanych komórek do identyfikacji terapii brodawczaka oddechowego AD 4

Panel C pokazuje zmieniony wzór restrykcji enzymu w genomie HPV-11 w komórkach nowotworowych. Wszystkie wskazane enzymy tylko raz wycięły prototypowy genotyp HPV-11 (numer dostępu GenBank, M14119.1). Po amplifikacji w kółku, HPV-11 z komórek płuc wykazywał dwa miejsca trawienia dla enzymów BamHI, Aatll, AgeI, FspI, XcmI i PpuMI. Panel D pokazuje sekwencję DNA zmutowanego HPV-11 w komórkach nowotworowych. Wirusowe DNA sklonowano i zsekwencjonowano. Otwarte ramki do czytania zostały przepowiedziane za pomocą narzędzia ORF Finder (National Center for Biotechnology Information), a mapa genomu została skonstruowana przy użyciu oprogramowania Vector NTI (Invitrogen). Powielona sekwencja zawierała sekwencje L1-LCR-E6-E7-E1, chociaż sekwencje L1 i E1 były tylko częściowo zduplikowane. Zanotowaliśmy zduplikowaną sekwencję jako L1 (B), LCR (B), E6 (B), E7 (B) i E1 (B). Startery specyficzne dla duplikacji lub ogólne startery PCR HPV-11, przedstawione w Tablicy E, zastosowano do wykrywania odpowiedniego HPV-11 w DNA wyizolowanym z komórek nowotworu płuc lub z tkanek płuc i tkanki krtaniowej zatopionych w parafinie. Chociaż ten pacjent cierpiał na chorobę długotrwałą, HPV w guzie nie było typowane. Używając ogólnych starterów do wykrywania HPV i swoistych dla typu HPV starterów, zidentyfikowaliśmy HPV-11 w hodowanych komórkach nowotworowych płuc (Figura 2A). Sekwencjonowanie produktów PCR wykazało, że wszystkie produkty pasują do DNA HPV-11. Oceniliśmy również ekspresję genów wirusa w komórkach i wykryliśmy informacyjny RNA (mRNA) dla genów E6 i E7, ale nie dla genu L1 (Figura 2B). W celu dalszej oceny zakażenia HPV-11 używaliśmy RCA do amplifikacji episomalnego DNA HPV. Zaskakująco, wzór trawienia enzymem restrykcyjnym nie pasuje do oczekiwanego dla HPV-11 (Figura 2C). Wszystkie wskazane enzymy restrykcyjne (BamHI, Aatll, AgeI, FspI, XcmI i PpuMI) powinny wyciąć wirusowy DNA jeden raz, aby wygenerować zlinearyzowany genom 7931 par zasad (numer dostępu w GenBank, M14119.1) .6 Zamiast tego, te enzymy cięte DNA dwa razy, wytwarzając fragmenty o wielkości około 8 kb i 2 kb. Ponadto oszacowano, że wielkość wirusowego genomu jest większa niż 10 kb, gdy uległa linearyzacji za pomocą Hindlll, XbaI lub SphI. Sugerowało to potencjalną duplikację regionu L1-LCR-E6-E7-E1.
Aby dodatkowo ocenić tę możliwość, sklonowaliśmy genom wirusa do wektora pUC19 i zsekwencjonowaliśmy go z dwóch kierunków. Według danych sekwencjonowania, zmutowany genom HPV-11 zawierał 10424 bp (numer dostępu w GenBank, JN644141) ze względu na duplikację 2493 bp, które zawierają częściowe sekwencje E1 częściowego L1-LCR-E6-E7 (Figura 2D). Startery specyficzne dla duplikacji użyto do zweryfikowania obecności zmutowanego genomu wirusa w komórkach nowotworowych płuc i odpowiedniej utrwalonej tkance nowotworu płuc (Figura 2E).
[więcej w: urazy klatki piersiowej, przyczyny nadmiernej potliwości, chomikuj przedszkole ]